Экспозиция посвящена времени расцвета усадьбы, который пришелся на эпоху правления царя Алексея Михайловича. Дворцовая усадьба была построена на искусственно созданном острове. Вокруг было создано крупнейшее экспериментальное хозяйство своего времени, включавшее обширные поля, аптекарский огород, льняную мануфактуру, стекольный завод, 37 прудов, пасеки, мельницы, маслобойки. Здесь выводили новые сорта сельскохозяйственных культур, изобретали и применяли первые сельскохозяйственные машины.
В экспозиции представлены: уникальная коллекция чертежей Измайловских земель, изразцы, сельскохозяйственные инструменты, памятники деревянной и белокаменной резьбы, подлинная водопроводная труба XVII века, кирпичи с клеймами царских кирпичных заводов, фрагменты Измайловских «Львиных» ворот, сохранившиеся благодаря усилиям архитектора-реставратора Петра Барановского. Один из наиболее интересных экспонатов — модель найденного Петром I английского бота «Святой Николай», ставшего «дедушкой русского флота».